天蓝淡红链霉菌SIPI 1482及其突变株代谢调控的研究
The studies on metabolic regulation in Streptomyces coeruleorubidus var.Zhengding SIPI 1482 and its mutants
柔红霉素(DAUNOMYCIN,DAUNORUBICIN)是临床应用上一个重要的蒽环类抗肿瘤药物,吸引了各国科学家对之进行深入的研究.人们致力于研究柔红霉素合成过程中的各步酶反应,克隆编码柔红霉素生物合成的基因,以期提高抗生素的产量和通过种间基因的克隆产生低毒、广谱的杂合抗生素. 天蓝淡红链霉菌正定变种SIPI 1482(STREPTOMYCES COERULEORUBIDUSVAR.ZHENGDING SIPI 1482)是柔红霉素的生产菌株.我们在研究中发现SIPI1482的产抗水平不稳定,菌种自然分离时出现不同程度的分离变异,这种菌落形态的变异与柔红霉素产量有一定的相关性.研究影响SIPI 1482菌种质量的外界因素,结果表明当菌种培养基以各种糖为碳源,各种无机氮为氮源,SIPI1482在30℃培养时,菌种的变异程度最小,菌种发酵的柔红霉素效价较高. 自然分离所得的突变株SIPI 1482-NS-1和紫外诱变获得的突变株SIPI1482-NS-4是柔红霉素生产菌株SIPI 1482的负突变株,不能合成柔红霉素.根据它们代谢产物的酸碱颜色变化、荧光颜色、TLC、HPLC分析以及与柔红霉素合成途径中不同位点发生阻断的突变株的共培养、共合成和生物转化实验的结果,可以判断突变株SIPI 1482-NS-1、SIPI 1482-NS-4不累积任何蒽环类化合物,在蒽环类化合物环化和芳香化前发生阻断,SIPI 1482-NS-1突变阻断在柔红霉素生物合成途径的聚酮体合成酶的DAUA位点前面,SIPI 1482-NS-4阻断在SIPI 1482-NS-1之前,这一结果将有助于阐明柔红霉素的生物合成途径. 阻断突变株SIPI 1482-NS-4不仅阻断位点与SIPI 1482-NS-1不同,而且在不能合成柔红霉素的GM培养基中添加2%NACL后,突变株SIPI 1482-NS-4恢复合成柔红霉素.研究NACL对突变株恢复合成柔红霉素的调控作用,发现这种调节作用依赖于NACL的存在,并且NACL必须在菌体生长对数期的前期加入.分析NACL调节突变株恢复合成柔红霉素起主要作用的因素,发现并非是高渗透压、〓或整个NACL分子,而是阳离子〓.NACL对亲株SIPI 1482同样具有刺激柔红霉素合成的调节作用,这在生产上对提高抗生素的产量有一定的意义. 进一步在细胞生物学水平上研究NACL调节突变株恢复合成柔红霉素的作用机制,结果发现2%NACL对SIPI 1482-NS-4菌丝细胞超微结构有显著影响:在GM培养基中添加2%NACL后,恢复合成柔红霉素的菌体细胞形态不规则,原生质膜不连续,胞内膜系统丰富,原生质有不同程度的质壁分离现象,出现囊泡.NACL还对菌体细胞的细胞膜组成影响较大.突变株添加2%NACL以后,短链的饱和脂肪酸减少,长链的不饱和脂肪酸增加,且细胞膜透性增大,说明膜的组成变化可能与SIPI 1482-NS-4恢复合成柔红霉素有关.GM培养基中添加2%NACL后,菌体细胞的脂肪含量下降,电镜也可观察到菌体细胞脂肪颗粒显著减少,说明NACL的调节作用可能使突变株部分合成脂肪的前体转向合成柔红霉素.氯霉素抑制实验表明NACL调节柔红霉素的合成涉及到蛋白质(酶)从头开始的新合成.突变株的GM培养基中添加NACL后,SDS-PAGE图谱显示突变株增加了2条分子量约为24,500KD、13,000KD的蛋白质谱带,NACL调节亲株合成柔红霉素同样涉及这2条蛋白质带. 从酶水平研究催化柔红霉素前体丙酰COA合成的甲基丙二酰COA羧基转移酶(MCT)和甲基丙二酰COA脱羧酶(MDC)活力的变化.结果表明在GM培养基中突变株的MCT酶和MDC酶的活力很低,但是添加2%NACL后,MDC酶活力迅速提高.说明SIPI 1482-NS-4在合成前体丙酰COA的位点发生阻断,NACL诱导了MDC酶,前体丙酰COA重新合成,从而使突变株恢复合成柔红霉素.亲株SIPI 1482在GM培养基MCT酶的活力较高,添加2%NACL后,诱导了MDC酶的活力,增加了前体丙酰COA的合成,柔红霉素产量提高.NACL诱导的MDC酶是位于细胞膜的可溶性酶.
- 作者：
- 钱秀萍
- 学位授予单位：
- 上海医药工业研究院
- 专业名称：
- 微生物药学
- 授予学位：
- 博士
- 学位年度：
- 1999年
- 导师姓名：
- 许文思；陈代杰
- 关键词：
- 抗生素；抗肿瘤药物；Streptomyces coeruleorubidus；柔红霉素；NaCl
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